關(guān)于液相色譜實(shí)驗技術(shù)問題解答

 
　　1、液相色譜是如何實(shí)現(xiàn)、快速、靈敏的?
 
　　解：氣相色譜理論和技術(shù)上的成就為液相色譜的發(fā)展創(chuàng)造條件，從它的、高速和高靈敏渡得到啟發(fā)，采用5一10四微粒出定相以提高柱效，采用高壓泵加快液體流動相的流速;設(shè)計高靈敏度、死體積小的紫外、熒光等檢測器，提高檢測靈敏度，克服經(jīng)典液相色譜曲缺點(diǎn)，從而達(dá)到、快速、靈敏。
 
　　2、與氣相色譜法相比液相色譜有哪些優(yōu)點(diǎn)和不足?
 
　　解：氣相色譜的分析對象是在校溫下具有一定的揮發(fā)性、對熱穩(wěn)定購物質(zhì)。因此它只限于分析氣體和沸點(diǎn)低的化合物或揮發(fā)性的衍生物。而液相色譜由于以液體作為流動相，只要被分析的物質(zhì)在選用的流動相中有一定的按解度，便可以分析，所以適用性廣，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，特別適合于那些沸點(diǎn)高、極性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性差的化合物，例如，生化物質(zhì)和藥物、離子型化合物、熱穩(wěn)定性差的天然產(chǎn)物等。在目前已知的有機(jī)化臺物中，
 
　　只有20%樣品可不經(jīng)化學(xué)處理而能滿意地用氣相色譜分離，80%的有機(jī)化合物要用液相色譜分析。
 
　　氣相色譜中流動相是惰性的，它對組分沒有作用力，僅起運(yùn)載作用、而液相色譜的流動相不僅起運(yùn)載作用，而且流動相對組分有一定親合力，可以通過改變流動相種類和組成提高分離的選擇性，另外可作流動相的化合物多，選擇余地廣。
 
　　與氣相色譜相比，液相色譜的另一個優(yōu)點(diǎn)是樣品的回收比較容易，只要開口容器放在柱子末端，就可以很容易地將所分離的各組分收集?；厥帐嵌康?，可以用來提純和制備具有足夠純度的單一物質(zhì)。
 
　　液相色譜不足的是，日前檢測器的靈敏度不及氣相色譜。必須特別注意“柱外效應(yīng)”對柱效率及色譜分離的影響。
 
　　3、試比較氣相色譜與液相色譜的H-u曲線，分析產(chǎn)生不同的原因。
 
　　解：從圖可看出，氣相色譜和液相色譜得到的H-u曲線，形狀迥然不同，流動相的流速對柱效的影響也不一樣，在氣相色譜的H-u曲線上，塔板高度H隨u變化呈雙曲線.曲線有一zui低點(diǎn)，這時柱效zui高，板高zui小，流速*。而液相色譜H-u曲線，未出現(xiàn)流速降低板高增加的現(xiàn)象，由于*流速趨近于零，一般觀察不到zui低板高相對應(yīng)的*流速。在正常的情況下，流速降低，板高H總是降低的，這與氣相色譜明顯不同。在氣相色譜中流動相流速增大，柱效呈直線降低，而在液相色譜中，流動相流速增大，柱效平緩降低。其主要原因是液相色譜的流動相為液體，液相的擴(kuò)散系數(shù)Dm很小，通常僅為氣相擴(kuò)散系數(shù)的104~105分之一，所以分子擴(kuò)散項在低u時也不起多大作用、因此液相色譜H-u曲線未能出現(xiàn)流速降低，板高增加現(xiàn)象。到高速時，雖然柱內(nèi)線速提高，但固定相和流動相的傳質(zhì)都能很快進(jìn)行，故H-u曲線上升緩慢。
 
　　4、簡述液相色譜中引起色譜峰擴(kuò)展的主要因素，如何減少諳帶擴(kuò)張、提高柱效?
 
　　解：液相色譜中引起色諾峰擴(kuò)展的主要因素為渦流擴(kuò)散、流動相傳質(zhì)、停留流動相傳質(zhì)及柱外效應(yīng)。
 
　　在液相色譜中要減小譜帶擴(kuò)張，提高柱效，要減少續(xù)料顆粒直徑，減小境料孔穴深度，提高裝填的均勻性，采用低粘度溶劑作流動相，流速盡可能低，同時要盡可能采用死體積較小的進(jìn)樣器、檢測器、接頭和傳輸管線等。
 
　　5、為什么要提出折合參數(shù)?有何特點(diǎn)?
 
　　解：我們知道色譜操作條件對板高是有影響的.Giddings發(fā)現(xiàn)，固定相相同，填充良好，共是粒度dp不同，因而H-u曲線不同，在液相色譜中，培板高度是粒度的函數(shù)，為了比較不向色譜條件下的板高H.提出折合參數(shù)，包括折合板高、折合流速、折合柱長。其特點(diǎn)是對于不同粒度的填料能得到相同的H—ur 曲線，因此可以在相同的條件下比較不同填料的柱效。
 
　　6、色譜柱A長度為15cm，載體粒度為5m.另一B柱長為30cm，載體粒度為10m，兩柱的柱效相等嗎?
 
　　解：A柱的折合柱長為30000，B柱的折合柱長也為30000，表明組分在兩根柱內(nèi)從柱人口到出口都經(jīng)過30000個載體顆粒.兩校的柱效相等。
 
　　7、何謂梯度淋洗，適用于哪些樣品的分析?與程序升溫有什么不同?
 
　　解：梯度淋洗就是在分離過程中.讓流動相的組成、極性、pH值等按‘定程序連續(xù)變化。使樣品中各組分能在*的k下出峰。使保留時間短、擁擠不堪、甚至重疊的組分，保留時間過長而峰形扁平的組分獲得很好的分離，特別適合樣品中組分的k值范圍很寬的復(fù)雜樣品的分析。梯度淋洗十分類似氣相色譜的程序升溫，兩者的目的相同。不同的是程序升溫是通過程序改變柱溫。而液相色譜是通過改變流動相組成、極性、pH值來達(dá)到改變k的目的。
 
　　8、流動相為什么要預(yù)先脫氣?常用的脫氣方法有哪幾種?
 
　　解：流動相中溶解氣體存在以下幾個方面的害處，氣泡進(jìn)入檢測器，引起光吸收成電信號的變化，基線突然跳動，干擾檢測;溶解在溶劑中的氣體進(jìn)入色譜柱時，可能與流動相或固定相發(fā)生化學(xué)反應(yīng);溶解氣體還會引起某些樣品的氧化降解.對分離和分析結(jié)果帶來誤差。因此，使用前必須進(jìn)行脫氣處理。常用的脫氣法有以下幾種：(1)加熱脫氣法;(2)抽吸脫氣法;(3)吹氦脫氣法;(4)超聲波振蕩脫氣法。
 
　　9、按固定相孔徑大小分類，液相色譜固定相有哪幾類?各有什么特性及適用范圍?
 
　　解：從固定相的孔隙深度考慮，液相色譜固定相分為表面多孔型(薄殼型)和全多孔型(全孔型)兩類。
 
　　表面多孔型固定相多孔層厚度小.孔淺，相對死體積小，出峰迅速，柱效高，顆粒較大，滲透性好，由于孔淺，梯度淋洗時，當(dāng)流動相成分改變后.孔內(nèi)外流動相成分能迅速達(dá)到平衡，機(jī)械強(qiáng)度高，裝柱容易，其不足的是由于多孔層厚度小，因而柱容量小，zui大允許樣品量受到限制，適用于比較簡單的樣品分析及快速分析。
 
　　全多孔型固定相，由于顆粒很細(xì)，孔仍然很淺.傳質(zhì)速度較快，柱效高。梯度淋洗時孔內(nèi)外流動相成分的平衡速度仍然較快.其zui大特點(diǎn)是柱容量大，zui大允許樣品量是表面多孔型的5倍，但裝填的什于滲透性低，因而需要更高的操作壓力.制柱比表面多孔型的難。這種固定相特別有利于痕量組分及多組分復(fù)雜混合物的分離分析。
 
　　10、什么叫化學(xué)鍵合色譜? 與液—液色譜相比有何優(yōu)點(diǎn)?
 
　　解：通過化學(xué)反應(yīng)，將固定液鍵合到載體表面，此種固定相稱為化學(xué)鍵合固定相;采用化學(xué)鍵合固定相的色譜法，稱為化學(xué)鍵合色譜。
 
　　與液—液分配色譜相比，鍵合色譜法的主要優(yōu)點(diǎn)：(1)化學(xué)鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用過程中不流失。(2)適宜用梯度淋洗。(3)適合于k范圍很寬的樣品。(4)由于鍵合到載體表面官能團(tuán)，既可是非極性的，也可是極性的，因此應(yīng)用面廣。
 
　　11、(選擇題)在液相色譜中，常用作固定相合相基體的物質(zhì)是
 
　　A.分子篩 B.硅膠 c氧化鋁 D.活性炭
 
　　解：B.硅膠。
 
　　要形成化學(xué)鍵合固定相，所用的基質(zhì)材料應(yīng)有某種化學(xué)反應(yīng)活性，在四種固體固定相中只有硅膠合有硅醇基，是能進(jìn)行鍵合的活性官能團(tuán)。
 
　　12、液相色譜柱有哪幾種類型? 細(xì)徑柱有什么優(yōu)點(diǎn)?
 
　　解：液相色譜拄大致可分為三種類型：內(nèi)徑小于2mm的稱為細(xì)管徑或微管徑柱;內(nèi)徑在2~5mm范圍內(nèi)的是常規(guī)液相色譜柱;內(nèi)徑大于5mm的一般稱為半制備柱或制備柱。細(xì)管徑柱的主要優(yōu)點(diǎn)是：(1)分離效能高。(2)流動相*流速低，消耗量少。(3)可采用多種檢測器，便于聯(lián)用(CLC MS，CLC-FTIR)。(4)采用細(xì)而短的毛細(xì)管柱可以提高分析速度，實(shí)現(xiàn)快速分析。
 
　　13、什么叫反相色譜?試從固定相、流動相、流出次序、流動相極性的影響等幾個方面比較正相和反相的區(qū)別。
 
　　解：流動相的極性比固定相的極性強(qiáng)的色譜體系叫反相色譜。例如以十八烷基硅膠鍵合相(ODS)為固定相，以甲酵/水作流動相，是典型的反相色譜。正相色譜和反相色譜這兩種操作模式的主要區(qū)別見下表：
 
　　正相和反相色譜的區(qū)別
 
　　比較項目正相色譜反相色譜
 
　　固定相
 
　　流動相
 
　　流出次序
 
　　流動相極性的影響極性
 
　　非(弱)極性
 
　　極性組分k大
 
　　極性增加，k減小非(弱)極性
 
　　極性
 
　　極性組分k小
 
　　極性增加，k增大
 
　　14、對液相色譜流動相有何要求?
 
　　解：用作液相色譜流動相的溶劑，其純度和化學(xué)特性必須滿足色譜過程中穩(wěn)定性和重復(fù)性的要求。對樣品要有一定的溶解能力，粘度小，化學(xué)穩(wěn)定性好，避免發(fā)生不可逆的化學(xué)吸附。溶劑應(yīng)與檢測器相匹配，不干涉所使用檢測器的工作，制備色譜的溶劑應(yīng)不干擾對分離各組分的回收。除此以外，選擇的溶劑對所給定的樣品組分具有合適的極性和良好的選擇性。
 
　　15、在150×2mm硅膠柱流動相為已烷/甲醇(150：2)，紫外檢測器色譜條件下分離丙烯酰胺，判斷以下組分的出峰次序，為什么?
 
　　解：在給定的色譜條件下，組分B先出峰，組分A后出峰。以硅膠為固定相，己烷/甲醇(150：2)為流動相，該體系為正相色譜，樣品的極性A>B，在正相色譜體系極性小的組分先出峰，極性大的組分后出峰，所以出峰次序為B先出，A后出。
 
　　16、在硅膠往上，用甲苯為流動相，某組分的保留時間為30min，如果改用四氯化碳或乙醚為流動相，試指出選用哪一種溶劑能減少該組分的保留時間? 為什么?
 
　　解：該體系為正向色譜體系。在該體系中流動相的極性增大保留值減小。流動相甲苯、四氯化碳及乙醚的溶劑強(qiáng)度參數(shù)分別是0.29、0.18、0.38，因此選用溶劑強(qiáng)度參數(shù)大于甲苯的乙醚，可縮短該化合物的保留時間。
 
　　17、在液相色譜中，組分和溶劑分子之間存在哪幾種作用力?
 
　　解：存在色散力、偶極作用、氫鍵作用和介電作用等四種作用力。
 
　　18、什么是溶劑極性參數(shù)與溶劑強(qiáng)度? 它們之間的關(guān)系如何?
 
　　解：溶劑分子與溶質(zhì)分子以色散力、偶極作用力、氫鍵作用力及介電作用力四種方式進(jìn)行相互作用的能力稱為分子的“極性”，溶劑的這種能力以溶劑極性參數(shù)P’表示，P’值越大，溶劑的極性越強(qiáng)。
 
　　溶劑強(qiáng)度指用作流動相的溶劑，將組分從色譜柱上洗脫下來的能力。
 
　　溶劑強(qiáng)度直接與溶劑的極性有關(guān)，而且隨不同色譜體系而變，在正相色譜體系中，溶劑極性增加，使組分從柱上洗脫下來的能力增加，即P’越大的溶劑，溶劑強(qiáng)度越大。在反相色譜中，溶劑極性減小，使組分從柱上洗脫下來的能力增加，即P’越小的溶劑，溶劑強(qiáng)度越大。
 
　　19、預(yù)測在正相色譜與反相色譜體系中，組分的出峰次序。
 
　　解：在正相色譜體系中組分的出峰次序為：極性弱的組分，在流動相中溶解度較大，因此k值小，先出峰。極性強(qiáng)的組分，在固定相中的溶解度較大，因此k值大，后出峰。
 
　　在反相色譜中組分的出峰次序為：極性弱的組分在固定相上的溶解度大，k值大，后出峰，相反極性強(qiáng)的組分在流動相中溶解度大，k值小，所以先出峰。
 
　　20、在ODS固定相上，以甲醇為流動相，某組分的分配容量k1=1.2，如以乙腈為流動相，其k增加還是減少? 為什么?
 
　　解：據(jù)題意為反相色譜體系。
 
　　k值增加，在反相色譜體系中，流動相由甲醇變?yōu)橐译妫軇O性參數(shù)由5.1變?yōu)?.8，增加了，但組分在流動相中的溶解度反而減小，所以k值增大。由1.2增大為2.24。
 
　　21、在反相色譜中，流動相從40%(V/V)甲醇—水改變?yōu)?0%(V/V)甲醇—水，問組分的調(diào)整保留值將改變多少? 為什么? (P’ 甲醇=5.1，P’ 水=5.1)
 
　　提示：對于由溶劑A和B組成的二元混合溶劑，其極性可表示為
 
　　Pab ‘=a P a’ b P b’
 
　　式中a和b分別為溶劑A和B在混合溶劑中的分?jǐn)?shù)。
 
　　解：在40%配比時，混合溶劑的極性為
 
　　P1’ =0.46×5.1 0.6×10.2=8.16
 
　　在60%配比時，混合溶劑的極性為
 
　　P2’ =0.6×5.1 0.4×10.2=7.14
 
　　P2’= P2’- P2’=7.14-8.16= -1.02
 
　　根據(jù)反相色譜體系
 
　　∴在反相色譜中，流動相的極性變?nèi)?P’由8.16變?yōu)?.14)，溶劑強(qiáng)度增加，洗脫能力增加，因而使組分的調(diào)整保留時間減少到原來的1/3.2。
 
　　22、某色譜體系采用25%三氯甲烷/正己烷為流動相，發(fā)現(xiàn)組分分離不十分理想，想通過改變流動相的選擇性來改善分離選擇性，選用乙醚/正己烷為流動相，問乙醚/正己烷的比例為多少? (P’ CHCl3=5.1，P’乙醚=5.1)
 
　　提示：流動相選擇性的改變是通過保持溶劑強(qiáng)度不變時改變流動相組成來實(shí)現(xiàn)的，改變前流動相A/B和改變后的流動相A/C的組成有下列關(guān)系：
 
　　解：25%的CHCl3/正己烷與37%乙醚/正己烷的溶劑強(qiáng)度相等，但對樣品的分離選鋒性不同。
 
　　23、什么叫離子色譜?
 
　　解：在低交換容量的分離柱上，分離樣品離子，而在高交換容量的抑制柱上，通過化學(xué)反應(yīng)，把具有高電導(dǎo)的流動相轉(zhuǎn)變?yōu)榈碗妼?dǎo)的流動相，這樣就可以在電導(dǎo)檢測器上對被分離樣品離子進(jìn)行高靈敏度的檢測。這種采用分離柱、抑制柱和電導(dǎo)檢測器相結(jié)合的離子交換色譜稱為離子色譜。
 
　　24、為什么凝膠色譜中任何組分的分配系數(shù)必須符合0≤K≤1?如果K>l說明什么問題?
 
　　解：因為組分的分配系數(shù)為K=Cs/Cm ，C s與Cm分別為組分在固定相和流動相中的濃度，當(dāng)分子直徑大于固定相孔徑時，此時Cm=0，∴K=0。當(dāng)分子直徑小于孔徑時，組分向孔隙內(nèi)流動相擴(kuò)散，達(dá)到平衡時，一半組分在孔隙內(nèi)，一半在孔隙外，此時K=1.0，若分子直徑介于以上兩種極限情況之間，K一定介于0與1之間.可見在凝膠色譜中，任何組分的分配系數(shù)為0≤K≤1，如果K>1，這說明此時的分離方式已不是純粹的凝膠色譜，其分離過程受到其他作用力(如吸附)的支配。
 
　　25、某人用凝膠色譜分離一高聚物樣品，分離情況很差，他改變流動相的組成后，分離情況大為改進(jìn)，這種說法對嗎? 為什么?
 
　　解：這種說法不對。在凝膠色譜中流動相只起運(yùn)載的作用，不能依靠改變流動相的性質(zhì)和組成來改善色譜體系的選擇性。凝膠色譜的選擇性只能通過選擇合適的固定相，根據(jù)固定相孔隙的大小以及孔徑分布范圍的*化來實(shí)現(xiàn)。題目中“改變流動相組成后，分離情況大為改進(jìn)”是不可能的。
 
　　26、(選擇題)液相色譜中通用型檢測器是
 
　　A.紫外吸收檢測器 B.示差折光檢測器 C熱導(dǎo)池檢測器 D.熒光檢測器
 
　　解：B.示差折光檢測器。
 
　　A、D為選擇性檢測器，C為氣相色譜中通用檢測器。
 
　　27、為了測定鄰氨基苯酚中微量雜質(zhì)苯氨，現(xiàn)有下列固定相：硅膠、ODS鍵合相，下列流動相：水—甲醇、異丙醚—己烷，應(yīng)選用哪種固定相、流動相? 為什么?
 
　　解：鄰氨基苯酚中微量雜質(zhì)苯氨測定，為了良好分離，應(yīng)讓苯氨先出峰，由于苯氨的極性小于鄰氨基苯酚，因此應(yīng)采用正相色譜法，應(yīng)選硅膠為固定相，異丙醚—己烷為流動相。
 
　　28、在ODS鍵合固定相，甲醇—水為流動相時試判斷四種苯并二氮雜苯的出峰順序。為什么?
 
　　解：色譜條件為反相鍵合色譜體系，在反相色譜體系中極性大的組分k小，首先出峰，按四種苯并二氮雜苯的結(jié)構(gòu)，出蜂順序為4—3—2—1。
 
　　29、用多孔凝膠為固定相，流動相為四氫呋喃，分離以下各組分，試判斷各組分的出蜂順序。為什么?
 
　　解：凝膠色譜組分的出峰次序是根據(jù)分子尺寸大小，大的先出峰.故出峰次數(shù)為n=9、8、7。
 
　　30、分離含胺類和季銨接的樣品，以0.2M HClO4溶液為固定相，以丁醇—二氯甲烷—己烷為流動相，已知組分A的保留時間為8.2min，死時間為1.0min.在另一根柱上.其他條件均不改變，只將HClO4的濃度增加一倍，間組分A在第二根柱上的移動速率，是在*根柱上的幾倍?
 
　　解：從題意分析知，該題分離類型是正相離子對色譜，因此K與KBP的關(guān)系為：
 
　　A在第二根柱上的移動速率是*根柱的1.78倍。